Біологічні системи: теорія та інновації

Біоінформатичний дизайн та пробна апробація ПЛР-системи для видової ідентифікації Candida spp. у біологічних зразках

Дмитро Прохоренко*

dmtr.prokhorenko@outlook.com

Завантажити статтю
Анотація

Видова ідентифікація представників роду Candida у складних біологічних зразках природного, агробіологічного та технологічного походження є необхідною для коректного аналізу змішаних мікробних угруповань і контролю мікробної контамінації та оцінювання потенційних джерел поширення грибкових патогенів. Метою дослідження було біоінформатичне обґрунтування, конструювання та пробна лабораторна верифікація системи полімеразної ланцюгової реакції для видової диференціації Candida glabrata, Candida parapsilosis і Candida auris. Дослідження передбачало аналіз рибосомного кластера, добір референтних послідовностей, комп’ютерне конструювання праймерів і гідролізних зондів, перевірку їх специфічності, оптимізацію реакційної суміші та тестування на контрольних зразках ДНК й архівних ізолятах біологічного походження. Як основну мішень було визначено ділянку внутрішніх транскрибованих спейсерів рибосомного кластера, що поєднувала консервативні фланкувальні фрагменти та варіабельні внутрішні послідовності. Для Candida glabrata, Candida parapsilosis і Candida auris було сформовано праймерно-зондові набори з розмірами ампліконів 82, 91 і 118 пар основ відповідно. Ампліфікаційну реакцію проводили в кінцевому об’ємі 25 мкл. Кінцева концентрація кожного праймера становила 0,28 мкМ, гідролізного зонда – 0,2 мкМ, MgCl₂ – 3 мМ, дНТФ – 0,3 мМ, бетаїну – 1,5 М. Позитивна ампліфікація була отримана для 40 позитивних контрольних зразків, серед яких було 29 зразків Candida spp., 7 зразків Candida glabrata і 4 зразки Candida parapsilosis. У негативній контрольній панелі, що включала 43 зразки нецільових мікроорганізмів, перехресної реактивності не виявлено. Запропонована система підтвердила придатність для первинної якісно-аналітичної видової ідентифікації окремих представників роду Candida у контрольованих лабораторних умовах. Розроблений підхід може бути використаний як основа для подальшого санітарно-біологічного скринінгу складних матриць ґрунтової, водної та рослинної мікробіоти, контролю біологічної безпеки в агропромисловості та подальшої адаптації до задач ранньої молекулярної детекції грибкових патогенів, важливих для інвазивних інфекцій

Ключові слова

рибосомний кластер; дріжджоподібні гриби; зонди; скринінг; мікробна контамінація; мікроорганізми

ЦИТУВАТИ
Prokhorenko, D. (2026). Bioinformatic design and pilot validation of a PCR assay for species-level identification of Candida spp. in biological samples. Biological Systems: Theory and Innovation, 17(3), 38-52. https://doi.org/10.31548/biologiya/3.2026.38
Використані джерела
  1. Akinbobola, A.B., Kean, R., Hanifi, S.M., & Quilliam, R.S. (2023). Environmental reservoirs of the drug-resistant pathogenic yeast Candida auris. PLoS Pathogens, 19(4), article number e1011268. doi: 10.1371/journal.ppat.1011268.
  2. Allison, J.C., & Hyland, E.M. (2025). From crops to clinic: The impact of dual azole use on antifungal resistance in Candida and Candida associated yeasts. Frontiers in Microbiology, 16, article number 1656723. doi: 10.3389/fmicb.2025.1656723.
  3. Ambrosio III, F.J., Scribner, M.R., Wright, S.M., Otieno, J.R., Doughty, E.L., Gorzalski, A., Siao, D., Killian, S., & Hess, D. (2023). TheiaEuk: A species-agnostic bioinformatics workflow for fungal genomic characterization. Frontiers in Public Health, 11, article number 1198213. doi: 10.3389/fpubh.2023.1198213.
  4. Babler, K., et al. (2023). Detection of the clinically persistent, pathogenic yeast spp. Candida auris from hospital and municipal wastewater in Miami-Dade County, Florida. Science of the Total Environment, 898, article number 165459. doi: 10.1016/j.scitotenv.2023.165459.
  5. Barber, C., Crank, K., Papp, K., Innes, G.K., Schmitz, B.W., Chavez, J., Rossi, A., & Gerrity, D. (2023). Community-scale wastewater surveillance of Candida auris during an ongoing outbreak in Southern Nevada. Environmental Science & Technology, 57(4), 1755-1763. doi: 10.1021/acs.est.2c07763.
  6. Berg, G., & Cernava, T. (2022). The plant microbiota signature of the Anthropocene as a challenge for microbiome research. Microbiome, 10(1), article number 54. doi: 10.1186/s40168-021-01224-5.
  7. Buil, J.B., van den Bosch, B., van der Maas, S.J., Meijer, E.F., de Groot, T., Meletiadis, J., & Pas, S.D. (2025). Performance evaluation of five real‐time PCR assays for the detection of Candida auris DNA. Mycoses, 68(5), article number e70065. doi: 10.1111/myc.70065.
  8. Chialva, M., Lanfranco, L., & Bonfante, P. (2022). The plant microbiota: Composition, functions, and engineering. Current Opinion in Biotechnology, 73, 135-142. doi: 10.1016/j.copbio.2021.07.003.
  9. Corrêa-Moreira, D., da Costa, G.L., de Lima Neto, R.G., Pinto, T., Salomão, B., Fumian, T.M., Mannarino, C., Prado, T., & Oliveira, M.M. (2024). Screening of Candida spp. in wastewater in Brazil during COVID-19 pandemic: Workflow for monitoring fungal pathogens. BMC Biotechnology, 24(1), article number 43. doi: 10.1186/s12896-024-00868-z.
  10. Djemiel, C., et al. (2024). Unraveling biogeographical patterns and environmental drivers of soil fungal diversity at the French national scale. Soil, 10(1), 251-273. doi: 10.5194/soil-10-251-2024.
  11. Fadiji, A.E., Adeniji, A., Lanrewaju, A.A., Adedayo, A.A., Chukwuneme, C.F., Nwachukwu, B.C., Aderibigbe, J., & Omomowo, I.O. (2025). Key challenges in plant microbiome research in the next decade. Microorganisms, 13(11), article number 2546. doi: 10.3390/microorganisms13112546.
  12. Fisher, M.C., et al. (2024). A one health roadmap towards understanding and mitigating emerging fungal antimicrobial resistance: fAMR. Npj Antimicrobials and Resistance, 2, article number 36. doi: 10.1038/s44259-024-00055-2.
  13. Freitas, B.L., Leach, L., Chaturvedi, V., & Chaturvedi, S. (2022). Reverse transcription-quantitative real-time PCR assay for the rapid enumeration of live Candida auris cells from the healthcare environment. Journal of Clinical Microbiology, 60(2), article number e00779-21. doi: 10.1128/JCM.00779-21.
  14. Kowalska, J., Krzymińska, J., & Tyburski, J. (2022). Yeasts as a potential biological agent in plant disease protection and yield improvement – a short review. Agriculture, 12(9), article number 1404. doi: 10.3390/agriculture12091404.
  15. Lima, A., Widen, R., Vestal, G., Uy, D., & Silbert, S. (2019). A TaqMan probe-based real-time PCR assay for the rapid identification of the emerging multidrug-resistant pathogen Candida auris on the BD Max system. Journal of Clinical Microbiology, 57(7), article number e01604-18. doi: 10.1128/JCM.01604-18.
  16. Oliveira, M.M., Proenca, A.M., Moreira‐Silva, E., Dos Santos, F.M., Marconatto, L., de Castro, A.M., & Medina‐Silva, R. (2022). Biochemical features and early adhesion of marine Candida parapsilosis strains on high‐density polyethylene. Journal of Applied Microbiology, 132(3), 1954-1966. doi: 10.1111/jam.15369.
  17. Orsud, H., Zoughbor, S., AlDhaheri, F., Hajissa, K., Refaey, S., Ajab, A., Alswaider, R., Mohamed, S., Alkaabi, O., & Al Rasbi, Z. (2025). Multi-marker comparative analysis of 18S, ITS1, and ITS2 primers for mycobiome profiling. Frontiers in Bioinformatics, 5, article number 1690766. doi: 10.3389/fbinf.2025.1690766.
  18. Pham, P., Shi, Y., Khan, I., Sumarah, M., Renaud, J., Sunohara, M., Craiovan, E., Lapen, D., Aris-Brosou, S., & Chen, W. (2024). The functions and factors governing fungal communities and diversity in agricultural waters: Insights into the ecosystem services aquatic mycobiota provide. Frontiers in Microbiology, 15, article number 1460330. doi: 10.3389/fmicb.2024.1460330.
  19. Rivera-Zizumbo, A.A., Velez, P., Ojeda, M., Herrera-Mares, A., Tapia-Torres, Y., & Gasca-Pineda, J. (2024). Implementing ITS1 metabarcoding for the analysis of soil microeukariotic diversity in the Mountain Cloud Forest. Journal of Soils and Sediments, 24(8), 3001-3012. doi: 10.1007/s11368-024-03839-1.
  20. Rossi, A., Chavez, J., Iverson, T., Hergert, J., Oakeson, J., LaCross, N., Njoku, C., Gorzalski, A., & Gerrity, D. (2023). Candida auris discovery through community wastewater surveillance during healthcare outbreak, Nevada, USA, 2022. Emerging Infectious Diseases, 29(2), 422-425. doi: 10.3201/eid2902.221523.
  21. Sautour, M., Lemaître, J.P., Ranjard, L., Truntzer, C., Basmaciyan, L., Depret, G., Hartmann, A., & Dalle, F. (2021). Detection and survival of Candida albicans in soils. Environmental DNA, 3(6), 1093-1101. doi: 10.1002/edn3.230.
  22. Sayers, E.W., Cavanaugh, M., Clark, K., Pruitt, K.D., Sherry, S.T., Yankie, L., & Karsch-Mizrachi, I. (2024a). GenBank 2024 update. Nucleic Acids Research, 52(1), 134-137. doi: 10.1093/nar/gkad903.
  23. Sayers, E.W., et al. (2024b). Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research, 52(1), 33-43. doi: 10.1093/nar/gkad1044.
  24. Schoch, C.L., Seifert, K.A., Huhndorf, S., Robert, V., Spouge, J.L., Levesque, C.A., & White, M.M. (2012). Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi. Proceedings of the National Academy of Sciences, 109(16), 6241-6246. doi: 10.1073/pnas.1117018109.
  25. Silva, I., Miranda, I.M., & Costa-de-Oliveira, S. (2024). Potential environmental reservoirs of Candida auris: A systematic review. Journal of Fungi, 10(5), article number 336. doi: 10.3390/jof10050336.
  26. Tavares, E.R., Santos, V.P., Castro, I.M., Borges, P.H., Silva-Rodrigues, G., Olak, A.P., Santos, J., Morey, A., & Yamauchi, L.M. (2025). Development of melting-curve-based real-time PCR for differentiating medically important candida species. International Journal of Molecular Sciences, 26(19), article number 9411. doi: 10.3390/ijms26199411.
  27. Thalinger, B., Deiner, K., Harper, L.R., Rees, H., Blackman, R., Sint, D., Traugott, M., Goldberg, C., & Bruce, K. (2021). A validation scale to determine the readiness of environmental DNA assays for routine species monitoring. Environmental DNA, 3(4), 823-836. doi: 10.1002/edn3.189.
  28. Valério, A.D., de Menezes, G.C., Rosa, C.A., & Johann, S. (2025). Into the wild: A look at Candida albicans outside the clinical setting. Journal of Fungi, 11(9), article number 622. doi: 10.3390/jof11090622.
  29. Viotti, C., Chalot, M., Kennedy, P.G., Maillard, F., Santoni, S., Blaudez, D., & Bertheau, C. (2024). Primer pairs, PCR conditions, and peptide nucleic acid clamps affect fungal diversity assessment from plant root tissues. Mycology, 15(2), 255-271. doi: 10.1080/21501203.2023.2301003.
  30. Winand, R., D’hooge, E., Van Uffelen, A., Bogaerts, B., Braekel, J., Hoffman, S., Roosens, N., Becker, P., Keersmaecker, S., & Vanneste, K. (2025). Investigating fungal diversity through metabarcoding for environmental samples: Assessment of ITS1 and ITS2 Illumina sequencing using multiple defined mock communities with different classification methods and reference databases. BMC Genomics, 26, article number 729. doi: 10.1186/s12864-025-11917-y.
  31. Zhu, S., Lei, Y., Wang, C., Wei, Y., Wang, C., & Sun, Y. (2021). Patterns of yeast diversity distribution and its drivers in rhizosphere soil of Hami melon orchards in different regions of Xinjiang. BMC Microbiology, 21(1), 170. doi: 10.1186/s12866-021-02222-1.
  32. Zulli, A., Chan, E.M., Shelden, B., Duong, D., Xu, X.S., White, B.J., Wolfe, M.K., & Boehm, A.B. (2024). Prospective study of Candida auris nucleic acids in wastewater solids in 190 wastewater treatment plants in the United States suggests widespread occurrence. mBio, 15(8), article number e00908-24. doi: 10.1128/mbio.00908-24.