Біологічні системи: теорія та інновації

Виявлення генів синтезу ліпопептидів методом RT-qPCR у ендофітних штамів Bacillus pumilus та Bacillus amyloliquefaciens

Вячеслав Шопінський*, Людмила Буценко, Олександр Субін, Юлія Коломієць

chemslava@gmail.com

Завантажити статтю
Анотація

Ендофітні бактерії роду Bacillus є перспективними агентами біологічного захисту рослин завдяки широкому спектру антимікробних метаболітів, зокрема циклічних ліпопептидів (ЦЛП). Ендофітні штами Bacillus pumilus E11 і Bacillus amyloliquefaciens E12, виділені з насіння Pinus sylvestris L., виявляли антагоністичну активність щодо фітопатогенних мікроорганізмів, однак молекулярно-генетичні засади цієї активності залишалися невстановленими. Метою дослідження було охарактеризувати транскрипційну активність генів синтезу ЦЛП – фенгіцину, сурфактину та ітурину А – у B. pumilus E11 і B. amyloliquefaciens E12 за допомогою RT-qPCR із перевіркою специфічності методом аналізу кривих плавлення. Тотальну РНК виділяли з чистих культур у стаціонарній фазі росту із застосуванням буфера GuSCN, що містив DTT і протеїназу K; ДНК усували шляхом оброблення DNase I; зворотну транскрипцію проводили з використанням набору RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, а RT-qPCR-аналіз здійснювали на ампліфікаторі CFX96 Opus (Bio-Rad) із застосуванням SYBR Green. Відносні рівні експресії розраховували методом 2-ΔΔСt, використовуючи 16S rRNA як референсний ген. У ході дослідження в обох досліджуваних штамах було виявлено ген fenD оперону фенгіцину, а його специфічність підтверджено піком плавлення в діапазоні 74,0-74,5 °C. Середнє значення Cq для ампліфікації fenD становило 30,3 для B. pumilus E11 і 29,8 для B. amyloliquefaciens E12, тоді як середні значення Cq для 16S rRNA дорівнювали 21,8 і 23,8 відповідно. Відносна транскрипційна активність гена біосинтезу фенгіцину у B. amyloliquefaciens E12 у 5,7 раза перевищувала відповідний показник у B. pumilus E11 (ΔΔCt = -2,5). Гени синтезу сурфактину (srfA) та ітурину А (ituA) не було виявлено в жодному зі штамів. Отже, серед досліджених ендофітних штамів фенгіцин виявився єдиним протигрибковим ЦЛП, транскрипційну активність якого було підтверджено, що узгоджувалося з установленою в попередніх дослідженнях активністю цих штамів щодо мікроміцетів Fusarium oxysporum і Alternaria alternata. Високий рівень транскрипції оперону fen у B. amyloliquefaciens E12 підтвердив потенціал цього штаму як продуцента протигрибкових метаболітів для біоконтролю патогенів рослин

Ключові слова

мікроорганізми; фенгіцин; біосинтез; оперон; біоконтроль; протигрибкова активність; Pinus sylvestris

ЦИТУВАТИ
Shopinskyi, V., Butsenko, L., Subin, O., & Kolomyets, Yu. (2026). Identification of lipopeptide synthesis genes by RT-qPCR in endophytic strains Bacillus pumilus and Bacillus amyloliquefaciens. Biological Systems: Theory and Innovation, 17(3), 22-37. https://doi.org/10.31548/biologiya/3.2026.22
Використані джерела
  1. Ahmad, T., Xing, F., Nie, C., Cao, C., Xiao, Y., Yu, X., Moosa, A., & Liu, Y. (2023). Biocontrol potential of lipopeptides produced by the novel Bacillus subtilis strain Y17B against postharvest Alternaria fruit rot of cherry. Frontiers in Microbiology, 14, article number 1150217. doi: 10.3389/fmicb.2023.1150217.
  2. Bakker, C., Graham, H.R., Popescu, I., Li, M., McMullin, D.R., & Avis, T.J. (2024). Fungal membrane determinants affecting sensitivity to antifungal cyclic lipopeptides from Bacillus spp. Fungal Biology, 128(7), 2080-2088. doi: 10.1016/j.funbio.2024.08.006.
  3. Balleux, G., Hofte, M., Arguelles-Arias, A., Deleu, M., & Ongena, M. (2025). Bacillus lipopeptides as key players in rhizosphere chemical ecology. Trends in Microbiology, 33(1), 80-95. doi: 10.1016/j.tim.2024.08.001.
  4. Breen, S., Solomon, P.S., Bedon, F., & Vincent, D. (2015). Surveying the potential of secreted antimicrobial peptides to enhance plant disease resistance. Frontiers in Plant Science, 6, article number 900. doi: 10.3389/fpls.2015.00900.
  5. Bustin, S.A., et al. (2009). The MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry, 55(4), 611-622. doi: 10.1373/clinchem.2008.112797.
  6. Cao, C.-Y., Hou, Z.-J., Ding, M.-Z., Gao, G.-R., Qiao, B., Wei, S.-Y., & Cheng, J.-S. (2025). Integrated biofilm modification and transcriptional analysis for improving fengycin production in Bacillus amyloliquefaciens. Probiotics and Antimicrobial Proteins, 17(5), 3067-3082. doi: 10.1007/s12602-024-10266-8.
  7. Chen, X.H., et al. (2007). Comparative analysis of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Nature Biotechnology, 25(9), 1007-1014. doi: 10.1038/nbt1325.
  8. Dobrzynski, J., Jakubowska, Z., Kulkova, I., Kowalczyk, P., & Kramkowski, K. (2023). Biocontrol of fungal phytopathogens by Bacillus pumilus. Frontiers in Microbiology, 14, article number 1194606. doi: 10.3389/fmicb.2023.1194606.
  9. Fan, H., Ru, J., Zhang, Y., Wang, Q., & Li, Y. (2017). Fengycin produced by Bacillus subtilis 9407 plays a major role in the biocontrol of apple ring rot disease. Microbiological Research, 199, 89-97. doi: 10.1016/j.micres.2017.03.004.
  10. Guo, Q., Dong, W., Li, S., Lu, X., Wang, P., Zhang, X., Wang, Y., & Ma, P. (2014). Fengycin produced by Bacillus subtilis NCD-2 plays a major role in biocontrol of cotton seedling damping-off disease. Microbiological Research, 169(7-8), 533-540. doi: 10.1016/j.micres.2013.12.001.
  11. Hazarika, D.J., Goswami, G., Gautom, T., Parveen, A., Das, P., Barooah, M., & Boro, R.C. (2019). Lipopeptide mediated biocontrol activity of endophytic Bacillus subtilis against fungal phytopathogens. BMC Microbiology, 19(1), article number 71. doi: 10.1186/s12866-019-1440-8.
  12. Livak, K.J., & Schmittgen, T.D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method. Methods, 25(4), 402-408. doi: 10.1006/meth.2001.1262.
  13. Ma, S., et al. (2025). Study on the inhibitory effects of three endophytic Bacillus strains on aspergillus flavus in maize. Metabolites, 15(4), article number 268. doi: 10.3390/metabo15040268.
  14. Markelova, N., & Chumak, A. (2025). Antimicrobial activity of Bacillus cyclic lipopeptides and their role in the host adaptive response to changes in environmental conditions. International Journal of Molecular Sciences, 26(1), article number 336. doi: 10.3390/ijms26010336.
  15. Ongena, M., Duby, F., Jourdan, E., Beaudry, T., Jadin, V., Dommes, J., & Thonart, P. (2005). Bacillus subtilis M4 decreases plant susceptibility towards fungal pathogens by increasing host resistance associated with differential gene expression. Applied Microbiology and Biotechnology, 67(5), 692-698. doi: 10.1007/s00253-004-1741-0.
  16. Ortiz, A., Vaca, J., Sansinenea, E., Argentel, L., Penuelas-Rubio, O., Kwon, S.-M., Andargie, Y.E., Shin, J.-H., Ali, S.A., El-Shabasy, A.E., & Azizoglu, U. (2025). Bacillus subtilis species complex: Secondary metabolites, genomic insights, and metabolite-driven strategies for sustainable agriculture. Journal of Environmental Chemical Engineering, 14(1), article number 120631. doi: 10.1016/j.jece.2025.120631.
  17. Romero, D., de Vicente, A., Rakotoaly, R.H., Dufour, S.E., Veening, J.-W., Arrebola, E., Cazorla, F. M., Kuipers, O.P., Paquot, M., & Pérez-García, A. (2007). The iturin and fengycin families of lipopeptides are key factors in antagonism of Bacillus subtilis toward Podosphaera fusca. Molecular Plant-Microbe Interactions, 20(4), 430-440. doi: 10.1094/MPMI-20-4-0430.
  18. Saggese, A., Culurciello, R., Casillo, A., Corsaro, M.M., Ricca, E., & Baccigalupi, L. (2018). A marine isolate of Bacillus pumilus secretes a pumilacidin active against Staphylococcus aureus. Marine Drugs, 16(6), article number 180. doi: 10.3390/md16060180.
  19. Shopinskyi, V., & Butsenko, L. (2026). Metabolic profile and biocontrol potential of endophytic bacteria Bacillus amyloliquefaciens E12. Ukrainian Food Journal, 15(1), 176-194. doi: 10.24263/2304-974X-2026-15-1-14.
  20. Shopinskyi, V.V., & Butsenko, L.M. (2025). Endophytic bacteria from seeds of Scots pine. Scientific Works of National University of Food Technologies, 31(2), 61-72. doi: 10.24263/2225-2924-2025-31-2-7.
  21. Vasilyeva, N., Kishynska, M.O., & Shtenikov, M.D. (2025). Analysis of biosynthetic gene clusters of Bacillus pumilus ONU 554 in silico. Microbiology & Biotechnology, 1(63), 25-47. doi: 10.18524/2307-4663.2025.1(63).327840.
  22. Wang, S., Wang, R., Zhao, X., Ma, G., Liu, N., Zheng, Y., Tan, J., & Qi, G. (2022). Systemically engineering Bacillus amyloliquefaciens for increasing its antifungal activity and green antifungal lipopeptides production. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 10, article number 961535. doi: 10.3389/fbioe.2022.961535.
  23. Yang, K., Dai, X., Maitikadir, Z., Zhang, H., Hao, H., & Yan, C. (2024). Comparative genome analysis of endophytic Bacillus amyloliquefaciens MR4: A potential biocontrol agent isolated from wild medicinal plant root tissue. Journal of Applied Genetics, 65(4), 907-923. doi: 10.1007/s13353-024-00905-9.
  24. Younas, H., Nazir, A., Bareen, F.-E., & Thies, J.E. (2023). Metabolic profile and molecular characterization of endophytic bacteria isolated from Pinus sylvestris L. with growth-promoting effect on sunflower. Environmental Science and Pollution Research, 30(14), 40147-40161. doi: 10.1007/s11356-022-25118-7.
  25. Zhang, D., Huang, K., Zou, D., Wang, B., Wu, X., Ye, C., & Wei, X. (2025). Enhanced Iturin a synthesis and antifungal effect of Bacillus amyloliquefaciens by genetic engineering of protease, ATP supply and itu operon. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 73(38), 24092-24101. doi: 10.1021/acs.jafc.5c05592.
  26. Zhao, J., Zhang, C., Lu, J., & Lu, Z. (2016). Enhancement of fengycin production in Bacillus amyloliquefaciens by genome shuffling and relative gene expression analysis using RT-PCR. Canadian Journal of Microbiology, 62(5), 431-436. doi: 10.1139/cjm-2015-0734.